Home » Туберкулёз » Подходы к иммунологической диагностике раннего периода первичной туберкулёзной инфекции у детей
Подходы к иммунологической диагностике раннего периода первичной туберкулёзной инфекции у детей

Подходы к иммунологической диагностике раннего периода первичной туберкулёзной инфекции у детей

С целью определения клинико-иммунологических особенностей раннего периода первичной туберкулёзной инфекции оценивали результаты модифицированной реакции бластной трансформации лимфоцитов (мРБТЛ) при стимуляции туберкулином у 200 детей от 3 до 7 лет, из них 131 ребёнок с положительной пробой Манту с 2ТЕ ППД-Л при отсутствии локальных проявлений туберкулёзной инфекции и 69 детей с отрицательными и сомнительными результатами туберкули­новых проб. Установлено, что основным диагностическим критерием раннего периода первичной туберкулёзной инфекции является значение индекса стимуляции (ИС). Среднее значение ИС — показателя пролиферации лимфоцитов у впервые инфицированных детей — 7,7 ±0,5. Определены высокая специфичность (97,9%) и чувствительность (97,8%) мРБТЛ с ППД-Л относительно пробы Манту с 2ТЕ ППД-Л.

М. А. ПЛЕХАНОВА, А. В. МОРДЫК, Л. И. ВЕРЕМЕЕВИЧ, Ю. И. ПАЦУЛА

В последнее десятилетие повсеместно на фоне роста иммунодефицитных состояний среди дет­ского населения отмечается рост различных за­болеваний, включая инфекционные, которые при­водят к развитию тяжёлой патологии с вовлече­нием в процесс различных органов и систем [2, 6, 9, 11]. Среди них особое место занимают соци­ально значимые инфекции, в том числе туберку­лёз. В связи с ростом заболеваемости туберкулё­зом в современной литературе продолжают ши­роко обсуждаться такие актуальные вопросы, как своевременное выявление раннего периода тубер­кулёзной инфекции у детей [1,3]. Наиболее пер­спективными для раннего выявления туберку­лёзной инфекции, как отмечают многие авторы, являются специфические иммунологические ме­тоды с количественным учётом результатов в со­четании с дифференцированным исследованием реактивности организма [4, 5, 8].

В то же время у детей увеличивается частота аллергических состояний, при которых проба Манту может быть ложноположительной, что, в свою оче­редь, затрудняет диагностику инфицирования ми­кобактериями туберкулёза (МВТ) [7].

Цель исследования — определение клинико­иммунологических особенностей раннего периода первичной туберкулёзной инфекции, оценка зна­чения модифицированной реакции бластной транс­формации лимфоцитов (мРБТЛ) при стимуляции туберкулином в определении раннего периода пер­вичной туберкулёзной инфекции у детей.

Материалы и методы

Проведено простое поперечное исследование. В соответствии с критериями включения (возраст пациентов от 3 до 7 лет, отсутствие локальных про­явлений туберкулёзной инфекции) в исследова­ние включено 200 пациентов, из них 131 ребёнок с положительными и 69 детей с отрицательными и сомнительными результатами туберкулиновых проб. В группах детей число мальчиков и девочек досто­верно не различалось (/? > 0,05).

В группе детей с положительными результа­тами туберкулиновых проб данные о вакцинации имелись у 124 (94,7%). Вакцинация оказалась эф­фективной у большинства детей — 113 (91,1%), неэффективной — у 1 (0,8%) ребёнка и малоэф­фективной — у 10 (8,1%) детей. Средний размер рубца у детей данной группы наблюдения соста­вил 4,4 ±0,1 мм. По данным туберкулинодиагно- стики (проба Манту с 2ТЕ ППД-Л), средний раз­мер инфильтрата составил 10,0 ± 0,2 мм, при этом у 62 (47,3%) детей отмечена слабоположитель­ная реакция (инфильтрат 5-9 мм), у 60 (45,8%) — средней интенсивности (инфильтрат 10-14 мм), у 8 (6,1%) — выраженная (инфильтрат 15-16 мм) и у 1 (0,8%) — гиперергическая реакция. На момент включения в исследование из всех детей с поло­жительными результатами туберкулиновых проб в VI группе диспансерного учёта наблюдались 107 (81,7%) детей, в диагностической (0) группе диспансерного учёта — 24 (18,3%) ребёнка.

В группе не инфицированных МВТ данные о вакцинации имелись у 67 (97,1%) детей, при этом она была эффективной также у большинства де­тей — 46 (68,7%), неэффективной — у 1 (1,5%) ребёнка и малоэффективной у 20 (29,8%) детей. Средний размер рубца в данной группе наблюде­ния составил 4,3 ± 0,3 мм. По результатам тубер- кулинодиагностики у 8 детей отметили отрица­тельную реакцию (отсутствие инфильтрата и ги­перемии), у 61 — сомнительную реакцию, при этом в 18 случаях была гиперемия, в 43 — инфильтрат

2-       4 мм. На момент обследования 24 (34,8%) ре­бёнка имели кратковременный контакт с больными туберкулёзом лёгких.

Все пациенты, включённые в исследование, обс­ледованы клинически с оценкой иммунного статуса и рентгенологически.

Определение уровня специфического клеточ­ного ответа осуществляли в РБТЛ с туберкули­ном (аллерген туберкулёзный очищенный сухой, сертификат № 000718, паспорт серия 153, конт­рольный № ОБТК 526, соответствует требова­ниям ФС 42-3302-96 — ППД-Л). Постановку РБТЛ проводили по Е. Bloemence et al. [12] в нашей мо­дификации (патент РФ № 2315315, 20.01.2008 г.) с использованием микрокультур цельной крови с фитогемагглютинином (ФГА) и ППД-Л без вы­деления лимфоцитов. При этом важно, что ис­пользовали малый объём крови (200 мкл), не было селективной потери Т-лимфоцитов и других кле­ток крови. Данная методика имеет отличия от общепринятых, поэтому приводим её описание. Контрольные образцы (0,01 мл) гепаринизиро- ванной крови (25 ед. гепарина на 1 мл крови) культивировали в круглодонных иммунологиче­ских планшетах в полной ростовой среде (ПРС) (среда 199, содержащая 10% эмбриональной те­лячьей сыворотки, L-глютамин (2 мМ), HEPES (10 мМ), гентамицина сульфат 50 мкг/мл). Опыт­ные образцы гепаринизированной крови (0,01 мл) культивировали в ПРС, содержащей ФГА (0,06 мл) и ППД-Л (0,06 мл) в 6 разведениях (50; 25; 12,5; 6,25; 3,1; 1,55 мкг/мл) в течение 120 ч. За 18 ч до окончания культивирования в культуры кле­ток (контрольную и опытную) вносили по 1 MKCi 3Н1-тимидина. По окончании культивирования клетки крови собирали полуавтоматическим сбор­щиком клеток на стекловолоконные фильтры и высушивали. Подсчёт радиоактивности в имп/мин проводили в сцинтилляционной жидкости с по­мощью камеры «Betta-2». Оценку уровня специ­фического клеточного ответа проводили по опре­делению индекса стимуляции (ИС).

Результаты исследования оценивали согласно общепринятым методам статистического анализа. Рассчитывали среднее арифметическое, стандарт­ную ошибку среднего, доверительные интервалы, критерий Крускала — Уоллиса, Манна — Уитни, коэффициент корреляции Спирмена и коэффи­циент знаковой корреляции. Различия считали достоверными при /7 < 0,05. Статистическую обра­ботку результатов проводили с применением пакета программ Biostat для персональных ЭВМ.

Результаты и обсуждение

Данные анамнеза и результаты объективного исследования не инфицированных МБТ детей достоверно не отличались от данных детей, нахо­дящихся в раннем периоде первичной туберку­лёзной инфекции (/? > 0,05, критерий z). Так, очаги неспецифической инфекции были выявлены у половины детей в каждой группе, при этом каж­дый второй ребёнок являлся часто болеющим. Проявление параспецифических реакций (уве­личение периферических лимфатических узлов, гепатомегалия, систолический шум на верхушке) отмечено у 70% детей в каждой группе, проявле­ния дисплазии соединительной ткани (сколиоз, нарушения осанки, плоскостопие, вадьгусная или варусная установка нижних конечностей, дефор­мация грудной клетки, аномальная хорда левого желудочка, пролапс митрального клапана и т. д.) выявлены у каждого пятого ребёнка в группах исследования. Функциональные нарушения со сто­роны пищеварительной системы установлены у 1 /3 детей в каждой группе.

При рентгенологическом исследовании орга­нов грудной клетки были выявлены патологиче­ские изменения в виде усиления лёгочного рисун­ка, нарушения структуры корня, при этом данные неспецифические изменения нами отмечены как в группе инфицированных детей, так и не инфици­рованных МБТ.

Показатели периферической крови детей, на­ходящихся в раннем периоде первичной тубер­кулёзной инфекции и не инфицированных МБТ, представлены в табл. 1. Результаты исследования периферической крови в группах не инфицирован­ных и впервые инфицированных МБТ детей до­стоверно не различались (/7 > 0,05).

У половины обследованных детей (53,4%) в раннем периоде первичной туберкулёзной инфек­ции отклонений от возрастной нормы не было. Лей­коцитоз выше 10 х 109/л встречался у 6 (4,6%) де­тей. Эозинофилия выше 5% отмечена у 8 (6,6%) детей, отсутствие эозинофилов (эозинопения) -


Картина периферической крови у детей, впервые инфицированных и не инфицированных МБТ

Показатели крови

Впервые инфицированные МБТ, п = 131

Не инфицированные МБТ, п = 69

Гемоглобин, г/л

123,5 ±0,8

122,6 ±1,0

СОЭ, мм/ч

5,0 ± 0,3

4,4 ±0,3

Лейкоциты, хю7л

7,1 ±0,2

7,6 ±0,2

Палочкоядерные нейтрофилы, %

1,4 ±0,1

1,2 ±0,2

Сегментоядерные нейтрофилы, %

48,6 ±0,9

49,8 ±1,3

Лимфоциты, %

43,0 ± 0,9

41,7 ± 1,3

Эозинофилы, %

2,0 ± 0,2

2,0 ±0,3

Моноциты, %

5,3 ± 0,2

5,3 ± 0,4

Базофилы, %

0

0


Примечание: * и в табл. 2 — достоверность различий между группами, р < 0,05 (критерий Манна -Уитни).


 

 

у 26 (21,3%), что может свидетельствовать о ран­нем этапе развития инфекции. Моноцитоз выяв­лен только у 4 (3,3%) детей, впервые инфицирован­ных МБТ. В период виража туберкулиновых проб увеличение СОЭ более 5 мм/ч было установлено у 38 (29%) детей, анемия — у 19 (14,5%) детей.

Показатели иммунограммы детей, находящих­ся в раннем периоде первичной туберкулёзной ин­фекции и не инфицированных МБТ, представ­лены в табл. 2. Достоверных различий в группах впервые инфицированных и не инфицированных МБТ нет (/? > 0,05).


 

Таблица 2

Параметры иммунологического анализа крови у детей, впервые инфицированных и не инфицированных МБТ

Показатели крови

Впервые инс

шцированные МБТ

Не инфицированные МБТ

п

М± т

п

М± т

Иммуноглобулин G, г/л

36

9,2 ± 0,3

31

9,2 ± 0,3

Иммуноглобулин А, г/л

36

1,1 ±0,1

31

1,0 ±0,1

Иммуноглобулин М, г/л

36

1,3 ±0,1

31

1,1 ±0,1

Иммуноглобулин Е, МЕ/мл

34

101,4 ±29,1

30

62,4 ±18,5

Фагоцитоз с латексом, %

33

66,7 ± 2,4

29

59,5 ± 3,3

НСТ-тест: спонтанный, %

35

19,8 ±2,3

31

23,6 ±2,5

стимулированный, %

34

44,1 ±4,5

28

40,0 ±4,2

Коэффициент прироста

34

3,1 ±0,5

28

2,2 ± 0,2

РБТЛ:

спонтанная, имп/мин

34

84,9 ± 8,2

31

106,8 ±17,2

стимулированная, ФГА, имп/мин

35

8648,0 ± 794,5

30

8765,0 ±858,4

Т-лимфоциты, абс.

18

2,8 ±0,2

16

2,5 ±0,2

Т-лимфоциты, %

18

74,8 ±1,6

16

71,4 ± 2,1

 

 

Установлено, что у детей в раннем периоде первичной туберкулёзной инфекции и не инфи­цированных МБТ с одинаковой частотой встре­чалось снижение ответа на ФГА в РБТЛ (88,6 и 80% соответственно) и спонтанного синтеза лимфоцитов (73,5 и 58,1% соответственно). При этом у детей выявили увеличение доли Т-лим- фоцитов (22,2 и 18,8% соответственно), что мож­но расценить как количественную компенсацию снижения их функциональной активности. Не­сколько чаще в период виража туберкулиновых проб отмечали повышенный уровень IgA (33,3 и 19,4%), IgM (16,7 и 3,2%), IgE (35,3 и 23,3%) и снижение IgG (5,6 и 6,5%). У пациентов обеих групп было выявлено снижение функциональ­ной способности фагоцитирующих нейтрофиль- ных гранулоцитов в реакции фагоцитоза с ла­тексом (27,3 и 48,3% соответственно) и резерв­ных возможностей нейтрофилов, коэффициент прироста был снижен до 64,3 и 64,7% в группах наблюдения.

Полученные результаты согласуются с мне­нием, что клинические, лабораторные и иммуно­логические показатели при отсутствии локальных проявлений туберкулёзной инфекции не могут с определённостью свидетельствовать о её наличии. Положительная реакция на туберкулин не всегда связана с истинным инфицированием МБТ из-за наличия поствакцинальной аллергии и парааллер­гии, что требует необходимости использования


Показатели мРБТЛ на ППД-Л у детей, инфицированных и не инфицированных МБТ

Группы наблюдения

п

Результат мРБТЛ на ППД-Л, ИС

М± т

Доверительный интервал

Не инфицированные МБТ

31

2,1 ±0,2

1,1-3,1

Инфицированные МБТ (всего)

107

7,4 ± 0,4*

3,5-11,3

Ранний период первичной туберкулёзной инфекции (вираж)

71

7,7 ± 0,5*

3,3-12,1

Примечание: * — достоверность различий по отношению к группе не инфицированных МБТ, р < 0,05 (критерий Крускала — Уоллиса).

 

дополнительных специфических методов ранней диагностики туберкулёзной инфекции.

Для диагностики инфицирования МБТ прове­ли оценку показателей мРБТЛ с ППД-Л у 162 де­тей. По результатам туберкулинодиагностики у 107 (66,1%) из них диагностировано инфициро­вание, у 24 (14,8%) детей — неуточнённое инфи­цирование. Здоровых, не реагирующих на тубер­кулин детей или с сомнительными результатами пробы Манту с 2ТЕ ППД-Л — 31(19,1%).

Результаты мРБТЛ с ППД-Л у детей, инфи­цированных и не инфицированных МБТ, отра­жены в табл. 3. У не инфицированных МБТ де­тей пролиферация лимфоцитов на туберкулин в мРБТЛ не выражена, при этом ИС находился в пределах 1,1-3,1.

У детей, инфицированных МБТ, без локаль­ных проявлений инфекции была выражена про­лиферация лимфоцитов на туберкулин в мРБТЛ, при этом ИС достоверно выше (р < 0,05), чем у не инфицированных МБТ. В раннем периоде первичной туберкулёзной инфекции ИС нахо­дился в пределах 3,3-12,1, при этом достоверных различий по результатам исследований у детей, инфицированных МБТ более года и находив­шихся в периоде виража туберкулиновых проб, нет (/? > 0,05). Среднее значение ИС — показа­теля пролиферации лимфоцитов у впервые ин­фицированных детей — 7,7 ± 0,5.

После определения диагностически значимых величин ИС в мРБТЛ были обследованы 24 ре­бёнка с положительными результатами пробы Манту с 2ТЕ ППД-Л, без локальных проявле­ний туберкулёзной инфекции из 0-й группы дис­пансерного наблюдения. У 14 детей со слабо­положительной реакцией Манту был установ­лен ИС ниже 3,1, что соответствовало уровню не инфицированных МБТ. В динамике у 11 из них после месячной подготовки (гипоаллерген- ная диета, санация хронических очагов инфек­ции, коррекция дисбиоза кишечника, дегельмин­тизация, приём сорбентов) была проведена про­ба Манту с 2ТЕ ППД-Л, во всех случаях отмети­ли снижение чувствительности к туберкулину до сомнительной реакции, что подтвердило отсут­ствие туберкулёзной инфекции. У 10 детей при реакции на пробу Манту средней интенсивности

ИС был равен 4,0-10,1, что позволило говорить об истинном инфицировании МБТ.

Таким образом, положительные результаты пробы Манту с 2ТЕ ППД-Л при выраженной про­лиферации лимфоцитов на туберкулин в мРБТЛ позволили диагностировать истинное инфици­рование МБТ и сократить сроки верификации диагноза, что дало возможность провести раннюю профилактику развития локальных форм тубер­кулёза. Положительные результаты пробы Манту с 2ТЕ ППД-Л при слабовыраженной пролифе­рации на туберкулин свидетельствовали о про­явлении парааллергии.

По результатам наших исследований, среди де­тей, инфицированных МБТ (диагноз установлен только по результатам туберкулинодиагностики), в 12% случаев можно говорить о гипердиагно­стике инфицирования.

Корреляционный анализ выявил наличие пря­мой сильной связи между размерами папулы при пробе Манту с 2ТЕ ППД-Л и величиной ИС в мРБТЛ с ППД-Л (г = 0,71 по Спирмену и г = 0,91 — коэффициент знаковой корреляции, р<0,001).

При определении специфичности и чувстви­тельности мРБТЛ с ППД-Л относительно про­бы Манту с 2ТЕ ППД-Л установлены высокая специфичность (97,9%) и чувствительность ме­тода (97,8%). Доля истинных результатов РБТЛ на ППД-Л составила 97,8 ± 1,1%.

Заключение

Результаты клинико-лабораторных и иммуно­логических исследований, проведённых в раннем периоде первичной туберкулёзной инфекции, не отличаются от таковых результатов здоровых, не инфицированных МБТ детей, что согласуется с мнением других авторов [10]. При этом объектив­ным и диагностически значимым для определения раннего периода первичной туберкулёзной инфек­ции является уровень пролиферативной активно­сти лимфоцитов на туберкулин в мРБТЛ (специ­фичность 97,9%, чувствительность 97,8%). Резуль­таты проведённых исследований мРБТЛ с ППД-Л позволили утверждать, что детей старше 3 лет с положительной туберкулиновой пробой, у кото­рых ИС не более 3,1, следует относить к группе не
инфицированных МБТ, а положительную реак­цию на пробу Манту с 2ТЕ ППД-Л у этих детей следует расценивать как парааллергию. Детей с положительной реакцией на пробу Манту с 2ТЕ ППД-Л и с ИС более 3,2 следует расценивать как истинно инфицированных МБТ.

По нашему мнению, использование мРБТЛ с ППД-Л в клинической практике позволит в каче­стве дополнительного исследования проводить диф­ференциальную диагностику инфекционной ал­лергии и парааллергии у детей старше 3 лет и осуществлять дифференцированный подход к про­ведению превентивного лечения.

ЛИТЕРАТУРА

  1. 1.        Александрова Е. Н., Морозова Т. И., Паролина Л. Е. Интер­претация комплексной когортной оценки результатов туберкули­нодиагностики // Пробл. туб. — 2008. — № 7. — С. 23-26.
  2. 2.        Алъбицкий В. Ю., Баранов А. А., Камаев И. А. Часто болею­щие дети. — Н. Новгород: НГМА, 2003. — 180 с.
  3. 3.        Борисов С. Е. Диагностика туберкулёза: возможности и пределы // Пробл. туб. — 2001. — № 3. — С. 5-10.
  4. 4.        Губкина М. Ф., Овсянкина Е. С., Баенский А. В. Ценность иммуноферментного анализа в диагностике и дифференциальной диагностике абациллярного туберкулёза у детей старшего возраста и подростков // Пробл. туб. — 2002. — № 12. — С. 16-18.
  5. 5.        Кноринг Б. Е., Фрейдлин И. С., Симбирцев А. С. Характер специфического иммунного ответа и продукция цитокинов моно- нуклеарами крови больных разными формами туберкулёза лёг­ких // Мед. иммунол. — 2001. — Т. 3, № 1. — С. 61-68.
  6. 6.        Коровина Я. А., Заплатников A. Л., Ревякина В. А. Новые аспекты применения иммуномоделирующей терапии у пациентов из групп риска // Поликлиника. — 2007. — № 6. — С. 95-98.
  7. 7.        Лебедева Л. В., Грачёва С. Г. Чувствительность к туберкули­ну и инфицированность микобактериями туберкулёза детей // Пробл. туб. — 2006. — № 1. — С. 5-9.
  8. 8.        Овчинникова Ю. Э. Клиническая значимость иммунологи­ческих и биохимических показателей в диагностике и лечении начальных проявлений туберкулёзной инфекции у детей: Авто- реф. дис…. канд. мед. наук. — СПб., 2000. — 23 с.
  9. 9.        Самсыгина Г. А. Часто болеющие дети: проблемы патогене­за, диагностики и терапии // Педиатрия. — 2005. — № 1. — С. 66-73.
  10. 10.     Саниев М. А. Клинико-социальные особенности формиро­вания инфицирования детей микобактериями туберкулёза: Авто- реф. дис…. канд. мед. наук. — М., 2003. — 23 с.
  11. 11.     Симованьян Э. Я, Денисенко В. Б., Григорян А. В. Часто болеющие дети: оптимизация программы лечения // Педиатрия. — 2007. — Т.86, № 4. — С. 79-85.
  12. 12.     Bloemence Е. et al. Whole-blood lymphocyte cultures // J. Immunol. Methods. — 1989. — Vol. 122, № 2. — P. 161-167.

Comments are closed.

Scroll To Top