Home » Туберкулёз » Результаты применения метода genotype MTBDRSL
Результаты применения метода genotype MTBDRSL

Результаты применения метода genotype MTBDRSL

Результаты применения метода genotype MTBDRSL для определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулёза к этамбутолу, офлоксацину, канамицину и капреомицину в архангельской области

Проведено сравнение результатов определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулёза к этамбутолу, офлоксацину, канамицину и капреомицину с помощью метода GenoType MTBDRs/ и метода абсолютных концентраций на среде Левенштейна — Йенсена у пациентов, у которых был впервые зарегистрирован туберкулёз с множественной лекарственной устой­чивостью (МЛУ) возбудителя в 2010 г. в Архангельской области.

Более половины пациентов с туберкулёзом с МЛУ возбудителя (57,7-80,5%), по результатам двух методов, выделяли мико­бактерии, устойчивые к этамбутолу. В то же время устойчивость к канамицину составила 7,3-14,6%, к капреомицину 7,3-10,6% и к офлоксацину 5,7% (по результатам методов GenoType MTBDRs/ и абсолютных концентраций соответственно).

У микобактерий туберкулёза, устойчивых к этамбутолу, наиболее часто встречалась мутация M306V (78,9%), у устойчивых к канамицину и капреомицину — мутация A1401G (77,8%), устойчивых к офлоксацину — мутация D94G (57,2%).

Чувствительность и специфичность метода GenoType MTBDRs/ для этамбутола составили 64,6% (95% -ный ДИ 54,3-73,8) и 70,8% (95%-ный ДИ 48,8-86,6), для канамицина — 27,8% (95%-ный ДИ 10,7-53,6) и 96,2% (95%-ный ДИ 90,0-98,8), для капреоми- цина — 53,8% (95%-ный ДИ 26,1-79,6) и 98,2% (95%-ный ДИ 92,9- 99,7), для офлоксацина — 57,1% (95%-ный ДИ 20,2-88,2) и 97,4% (95%-ный ДИ 92,1-99,3) соответственно.

Результаты метода MTBDRs/ в случаях обнаружения мутаций свидетельствуют о высокой вероятности устойчивости М. tuberculosis к препарату. Отсутствие мутаций в исследуемых генах требует проведения дополнительных методов определения лекарственной чувствительности для подтверждения результата.

В Российской Федерации применяют различ­ные методы, позволяющие в короткие сроки и с высокой степенью достоверности определить ле­карственную чувствительность возбудителя ту­беркулёза к основным препаратам первого ряда — рифампицину и изониазиду (GeneXpert, Cepheid [5], MTBDR, Hain Lifescience [8], ТБ-Биочип, ООО «Биочип-ИМБ» [1]). При диагностике мно­жественной лекарственной устойчивости (МЛУ) возникает необходимость дальнейшего определе­ния лекарственной чувствительности к препара­там второго ряда, а также этамбутолу Получение достоверных результатов определения лекарствен­ной чувствительности М. tuberculosis позволяет назначать необходимую комбинацию препаратов, эффективно осуществлять меры инфекционно­го контроля, а также своевременно изолировать больного туберкулёзом с широкой лекарственной устойчивостью возбудителя. В соответствии с при­казом Министерства здравоохранения РФ № 109 в противотуберкулёзных учреждениях для опре­деления лекарственной чувствительности к этим препаратам применяют метод абсолютных концен­траций на среде Левенштейна — Йенсена [2]. Так­же используют молекулярно-генетический метод исследования — GenoType МТБ DRsi, в основе ко­торого лежит выявление мутаций ДНК возбудите­ля туберкулёза, обусловливающих устойчивость к этамбутолу (ген етЬВ), фторхинолонам (ген gyrA) и инъекционным противотуберкулёзным препа­ратам (ген rrs) [6], что позволяет сократить время получения данных о лекарственной чувствитель­ности М. tuberculosis [3, 4, 7-9]. В то же время оба эти метода не имеют такой высокой достоверно­сти, как тесты лекарственной чувствительности к изониазиду и рифампицину. В результате иссле­дований, проведённых ранее другими авторами, получили различные данные о чувствительности и специфичности метода GenoType MTBDRs/ [3, 4, 7, 9]. Данных о результатах применения метода GenoType MTBDRs/ в сравнении с результатами метода абсолютных концентраций не обнаружено.

Цель исследования — сравнение результатов определения лекарственной чувствительности к этамбутолу, офлоксацину, канамицину и ка- преомицину с использованием метода GenoType MTBDRs/ и метода абсолютных концентраций на среде Левенштейна — Йенсена у впервые выявлен­ных больных и больных с рецидивом, у которых был впервые зарегистрирован туберкулёз с МЛ У возбудителя в 2010 г. в Архангельской области.

Материалы и методы

В 2010 г. на территории Архангельской области было зарегистрировано 574 впервые выявленных больных туберкулёзом всех локализацией («но­вый случай») и 87 больных с рецидивом туберку­лёзного пароцесса («рецидив»). Среди 512 боль­ных туберкулёзом лёгких, отнесённых к группе «новый случай», у 252 бактериовыделение выяв­лено с использованием метода простой микроско­пии (49,2%), у 322 — метода посева (62,9%). Среди 83 больных туберкулёзом лёгких, отнесённых к группе «рецидив», у 45 бактериовыделение уста­новлено с помощью метода простой микроскопии (54,2%), у 61 — метода посева (73,5%). В Архан­гельской области больные туберкулёзом с МЛ У возбудителя среди впервые выявленных больных туберкулёзом и больных с рецидивом составили 34,9 и 69,1% соответственно (всего 145 человек).

При выявлении устойчивости микобактерий ту­беркулёза к рифампицину и изониазиду применя­ли метод MTBDRs/для определения чувствитель­ности туберкулёзного возбудителя к этамбутолу, фторхинолонам и инъекционным препаратам. Для выявления чувствительности к препаратам второ­го ряда также выполняли исследование диагности­ческого материала с помощью метода абсолютных концентраций на среде Левенштейна — Йенсена.

Метод GenoType MTBDRs/ осуществляли с использованием как нативного материала (85 че­ловек — 58,6%), так и выделенных культур (60 человек — 41,4%) в соответствии с инструкциями производителя [6]. Метод абсолютных концентра­ций выполняли в соответствии с приказом Мини­стерства здравоохранения Российской Федерации №109 от 21.03.2003 г. [2].

Результат метода абсолютных концентраций не был получен у 22 человек из-за отсутствия ро­ста М. tuberculosis на питательной среде (21 чело­век) и смертью одного пациента до начала лече­ния. Результат метода GenoType MTBDRs/ был получен у всех 145 пациентов. Полученные у 123 человек результаты MTBDRs/ сравнили с резуль­татами метода абсолютных концентраций на среде Левенштейна — Йенсена.

Результаты и обсуждение

Среди 123 пациентов с туберкулёзом с МЛ У возбудителя чувствительность к этамбутолу с по­мощью метода абсолютных концентраций была выявлена у 99 (80,5%) человек, метода GenoType MTBDRs/ — у 71 (57,7%) человека. Мутации в гене етЬВ, обнаруженные в ходе исследования, пред­ставлены в табл. 1. У 2 пациентов отмечали одно­временное присутствие как «проб дикого типа» (wild type probes), так и мутаций. В обоих случаях присутствовала мутация M306V гена етЬВ.

Таблица 1

Мутации в гене етЬВ, обнаруженные в ходе исследования

Отсутствую­щие «пробы дикого типа» (wild type probes)

Присут­

ствующие

мутации

(mutation

probe)

Мутации

Количество

штаммов

абс.

%

embB^Nl

MUT1A

M306I

12/71

16,9

embB WT

MUT1B

M306V

54/71

76,1

embB WT

-

M306I

3/71

4,2

-

MUT1B

M306V

2/71

2,8

 

Совпадение результатов двух методов отме­чено у 81 (65,9%) пациента. Чувствительность и специфичность метода GenoType MTBDRs/ для этамбутола составили 64,6% (95%-ный ДИ 54,3- 73,8) и 70,8% (95%-ный 48,8-86,6) соответственно.

Устойчивость к канамицину с использованием метода абсолютных концентраций была выявлена

у 18 (14,6%) из 123 пациентов, метода GenoType MTBDRs/ — у 9 (7,3%). Мутации в гене rrs, обна­руженные в ходе исследования, представлены в табл. 2. У 2 пациентов отмечали одновременное присутствие как «проб дикого типа» (wild type probes), так и мутаций. В одном случае присут­ствовала мутация A1401G гена rrs, в другом — му­тация G1484T.

Таблица 2

Мутации в гене rrs, обнаруженные в ходе исследования

Отсутствующие «пробы дикого типа» (wild type probes)

Присутствующие мутации (mutation probe)

Мутации

Количество

штаммов

rrs WT1

MUT1

A1401G

6/9

-

MUT1

A1401G

1/9

rrs WT 1

-

C1402T

1/9

rrs WT 2

MUT 2

G1484T

-

-

MUT 2

G1484T

1/9

 

Совпадение результатов двух методов отме­чали у 106 (86,2%) пациентов. Чувствительность и специфичность метода GenoType MTBDRs/ для канамицина составили 27,8% (95%-ный ДИ 10,7- 53,6) и 96,2% (95%-ный ДИ 90,0-98,8) соответ­ственно.

Устойчивость к капреомицину методом абсо­лютных концентраций была выявлена у 13 (10,6%) из 123 пациентов, методом GenoType MTBDRs/ — у 9 (7,3%) (табл. 2).

Совпадение результатов двух методов отме­чали у 115 (93,5%) пациентов. Чувствительность и специфичность метода GenoType MTBDRs/ для капреомицина составили 53,8% (95%-ный ДИ 26,1-79,6) и 98,2% (95%-ный ДИ 92,9-99,7) соот­ветственно.

Устойчивость к офлоксацину 2 методами была выявлена у 7 (5,7%) из 123 пациентов. У одного па­циента отмечали одновременное присутствие как «проб дикого типа» (wild type probes), так и мута­ций. Мутации в гене gyrA, обнаруженные в ходе исследования, представлены в табл. 3.

Совпадение результатов двух методов отме­чали у 117 (95,1%) пациентов. Чувствительность и специфичность метода GenoType MTBDRs/ для

Таблица 3

Мутации в гене gyrA, обнаруженные в ходе исследования

Отсутствующие «пробы дикого типа»

(wild type probes)

Присутствующие мутации (mutation probe)

Мутации

Коли­

чество

штаммов

gyrA WT2

MUT1

A90V

2/7

gyrA WT2

MUT2

S91P

1/7

gyrA WT3

MUT3C

D94G

3/7

-

MUT3C

D94G

1/7

 

офлоксацина составили 57,1% (95%-ный ДИ 20,2- 88,2) и 97,4% (95%-ный 92,1-99,3) соответственно.

После проведённого анализа данных было определено, что более половины больных тубер­кулёзом с МЛУ возбудителя (57,7 — 80,5%), по результатам двух методов, выделяли микобакте­рии, устойчивые к этамбутолу. Данные показатели свидетельствуют, что у значительного числа паци­ентов с туберкулёзом с МЛУ возбудителя приме­нение этамбутола будет невозможным ввиду на­личия лекарственной устойчивости возбудителя туберкулёза. При этом устойчивость к канамици­ну составила 7,3-14,6%, к капреомицину 7,3-10,6% и к офлоксацину 5,7% (по результатам методов GenoType MTBDRs/ и абсолютных концентраций соответственно).

Среди 22 пациентов, у которых не был полу­чен результат метода абсолютных концентраций и которые не были включены в группу сравнения, по результатам метода GenoType MTBDRs/ устой­чивость МВТ к этамбутолу была определена у 9 пациентов, к канамицину и капреомицину — у 2 пациентов, к офлоксацину — у 3.

По результатам метода GenoType MTBDRs/ было установлено, что у микобактерий туберку­лёза, устойчивых к этамбутолу, наиболее часто встречалась мутация M306V (78,9%), устойчивых к канамицину и капреомицину — мутация A1401G (77,8%), устойчивых к офлоксацину — мутация D94G (57,2%).

При определении лекарственной чувствитель­ности микобактерий туберкулёза к этамбутолу расхождения двух методов отмечали в 42 (34,1%) случаях. У 35 фенотипически устойчивых к этам­бутолу штаммов GenoType MTBDRs/ не выявил мутаций, что может свидетельствовать о мутаци­ях в других участках гена етЬВ, например кодоны 319 и 497, либо в других генах, например етЬА, етЬС и embR, анализ которых невозможен мето­дом MTBDRs/ [7], или об ошибке фенотипическо­го метода.

У 7 штаммов, чувствительных к этамбутолу, по результатам метода абсолютных концентраций были обнаружены мутации (табл. 4).

Расхождения результатов двух методов отме­чали в 17 случаях определения чувствительности к канамицину, среди которых у 13 фенотипически

Таблица 4

Мутации в гене етЬВ, обнаруженные у фенотипически чувствительных к этамбутолу штаммов

Отсутствующие «пробы дикого типа»

(wild type probes)

Присутствую­щие мутации (mutation probe)

Мутации

Коли­

чество

штаммов

етЬВ WT

MUT1A

M306I

1/7

етЪВ WT

MUT IB

M306V

4/7

етЬВ WT

-

M306I

1/7

-

MUT IB

M306V

1/7

 

устойчивых к канамицину штаммов GenoType MTBDRs/ не выявил мутаций. При определении чувствительности к капреомицину расхождения отмечали в 8 случаях, среди которых у 6 феноти­пически устойчивых к капреомицину штаммов GenoType MTBDRs/ не выявил мутаций. Метод GenoType MTBDRs/ позволяет определить мута­ции в определённых локусах гена rrs, ответствен­ных за устойчивость одновременно к канамицину и капреомицину [6]. Однако наличие штаммов, устойчивых к канамицину с сохранённой чув­ствительностью к капреомицину без мутаций в данном гене, что отмечали у 8 пациентов, может свидетельствовать о наличии мутаций в других участках, ответственных за «моноустойчивость» к канамицину, например в гене eis [3, 4, 7, 9], или об ошибке метода абсолютных концентраций.

Также у 4 штаммов, чувствительных к канами­цину, и 2 штаммов, чувствительных к капреомици­ну, по результатам метода абсолютных концентра­ций были обнаружены мутации (табл. 5 и 6).

Таблица 5

Мутации в гене rrs, обнаруженные у фенотипически чувствительных к канамицину штаммов

Отсутствующие «пробы дикого типа»

(wild type probes)

Присутствующие мутации (mutation probe)

Мутации

Коли­

чество

штаммов

rrs WT1

MUT1

A1401G

2/4

rrs WT 1

-

C1402T

1/4

-

MUT 2

G1484T

1/4

 

Таблица 6

 

 

Мутации в гене rrs, обнаруженные у фенотипически чувствительных к капреомицину штаммов

Отсутствующие «пробы дикого типа»

(wild type probes)

Присутствующие мутации (mutation probe)

Мутации

Коли­

чество

штаммов

rrs WT1

MUT1

A1401G

1/2

-

MUT 2

G1484T

1/2

 

При определении лекарственной чувствитель­ности микобактерий туберкулёза к офлоксацину расхождения результатов двух методов отмечали в 6 случаях, среди которых 3 были определены как чувствительные к офлоксацину с помощью ме­тода абсолютных концентраций, но устойчивые — с использованием метода GenoType MTBDRs/ (табл. 7).

У оставшихся 3 штаммов, фенотипически устойчивых к офлоксацину, мутаций не выявле­но. В данных случаях можно предположить на­личие дополнительных мутаций, не выявляемых GenoType MTBDRs/, например в генах gyrB или mfpA [3, 4, 7, 9], или ошибку теста лекарственной чувствительности на плотной питательной среде.

Таблица 7

Мутации в гене gyrA, обнаруженные у фенотипически чувствительных к офлоксацину штаммов

Отсутствующие «пробы дикого типа» (wild type probes)

Присутствую­щие мутации (mutation probe)

Мута­

ции

Кол-во

штаммов

gyrA WT3

MUT3C

D94G

2/3

-

MUT3C

D94G

1/3

 

Чувствительность и специфичность мето­да GenoType MTBDRs/ ниже, чем у GenoType MTBDRplus, что можно объяснить как наличием мутаций у М. tuberculosis, не определяемых данным методом, так и недостатками метода абсолютных концентраций на среде Левенштейна — Йенсена, который был использован в данном исследовании для сравнения при обнаружении мутаций у фено­типически чувствительных штаммов.

Заключение

Результаты метода MTBDRs/ в случаях об­наружения мутаций свидетельствуют о высокой вероятности устойчивости М. tuberculosis к пре­парату и позволяют своевременно выявить случаи туберкулёза с устойчивостью к этамбутолу и пре­паратам второго ряда. Однако отсутствие мутаций в исследуемых генах требует проведения дополни­тельных методов определения лекарственной чув­ствительности для подтверждения результата.

ЛИТЕРАТУРА

  1.  Дауров Р. Б., Васильева И. А., Перфильев А. В. и др. Клини­ко-рентгенологическая динамика у впервые выявленных больных туберкулёзом лёгких с множественной лекарственной устойчиво­стью микобактерий при раннем назначении резервной схемы хи­миотерапии по данным тест-системы «ТБ-Биочип» // Туб. — 2010. -Т. 87, №4.-С. 10-13.
  2.  Министерство здравоохранения Российской Федерации. Приказ № 109 от 21.03.2003 г.
  3.  Brossier Е, Veziris N., Aubry A. et al. Detection by GenoType MTBDRsl Test of Complex Mechanisms of Resistance to Second- Line Drugs and Ethambutol in Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Complex Isolates //J. Clin. Microbiol. — 2010. — Vol. 48, № 5. — P. 1683-1689. Published online 2010 March 24. doi: 10.1128/ JCM.01947-09.
  4.  Campbell P. J., Morlock G. P., Sikes R. D. et al. Molecular Detection of Mutations Associated with First- and Second-Line Drug Resistance Compared with Conventional Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob Agents Chemother. — 2011. — Vol. 55, № 5. — P. 2032-2041. doi: 10.1128/AAC.01550-10.
  5.  Chang K. et al. Rapid and effective diagnosis of tuberculosis and rifampicin resistance with Xpert MTB/RIF assay: A meta-analysis //J. Infect. — 2012. — doi:10.1016/j.jinf.2012.02.012.
  6.  Hain Lifescience, Genotype MTBDRsl, Ver. 1.0, IFU-317-03, March 2010.
  7.  Huang W.-L., Chi T.-L., Wu M.-H. et al. Performance Assessment of the GenoType MTBDRsl Test and DNA Sequencing for Detection of Second-Line and Ethambutol Drug Resistance among Patients Infected with Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis //J. Clin. Microbiol. — 2011. — Vol. 49, № 7. — P. 2502- 2508, doi: 10.1128/JCM.00197-11.
  8.  Ling D. I., Zwerling A. A., Pai M. GenoType MTBDR assays for the diagnosis of multidrug-resistant tuberculosis: a meta-analysis // Eur. Resp. J. — 2008.
  9.  Said H. М., Коек М. М., Ismail N. A. et al. Evaluation of the GenoType® MTBDRsl assay for susceptibility testing of second-line anti-tuberculosis drugs // Int. J. Tuberc. Lung Dis. — 2012. — Vol. 16, № 1. — P. 104-109.

ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:

Елисеев Платон Иванович

Северный государственный медицинский университет, аспирант кафедры фтизиопульмонологии.

163000, г. Архангельск, просп. Троицкий, д. 51.

Тел./факс: (8182) 28-57-91, (8182) 28-65-95.

Comments are closed.

Scroll To Top